Pengaruh PERBANDINGAN ETANOL-AIR SEBAGAI PELARUT EKSTRAKSI terhadap perolehan ekstaktif, kadar senyawa fenolat dan aktivitas antioksidan dari DAUN JAMBU BIJI (PSIDIUM GUAJAVA Linn.)

Harrizul Rivai1,*, Hazli Nurdin2, Hamzar Suyani2 dan Amri Bakhtiar1 
1 Fakultas Farmasi, Universitas Andalas, Padang
2 Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Andalas, Padang
* Corresponding author: HP: 081363049858; email: harrizul@yahoo.co.id 

ABSTRACT

Effect of ethanol-water ratio as extraction solvent in gaining of extractive, phenolic content and antioxidant activity in Psidium guajava Linn. leaves have been investigated. The ethanol-water ratio tested were 100:0, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 and 40:60. Results revealed that ethanol-water ratio gave significant effect on extractive obtainability, phenolic content and antioxidant activity (p<0,05). Among the ethanol-water ratio tested, the best result was obtained by ethanol-water ratio 50:50 as extraction solvent for Psidium guajava Linn. leaves.
Keywords : Antioxidant, Psidium guajava Linn., extraction solvent, phenolic compounds.

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian mengenai pengaruh perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi terhadap perolehan kadar ekstraktif, senyawa fenolat dan aktivitas antioksidan dalam daun jambu biji (Psidium guajava Linn.). Perbandingan etanol-air yang diuji adalah 100:0, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 dan 40:60. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbandingan etanol-air memberikan pengaruh yang nyata terhadap perolehan ekstraktif, kadar senyawa fenolat dan aktivitas antioksidan (p<0,05). Di antara perbandingan etanol-air yang diuji, hasil yang terbaik ditunjukkan oleh perbandingan etanol-air 50:50 sebagai pelarut ekstraksi untuk daun jambu biji. 
Kata kunci : Antioksidan, Psidium guajava Linn., pelarut ekstraksi, senyawa fenolat, 

PENDAHULUAN
Jambu biji (Psidium guajava Linn.) adalah salah satu tumbuhan obat Indonesia yang telah lama digunakan secara turun-temurun untuk pengobatan berbagai penyakit seperti antidiare, astringens dan menghentikan perdarahan (Ditjen POM, 1989), disentri, haid tidak lancar, keputihan, mencret, pencernaan tidak baik pada anak-anak, radang usus, sariawan usus, panu (obat luar) dan sakit kulit (obat luar) (Sudibyo, 1998). Daun jambu biji telah terbukti mempunyai berbagai efek farmakologis, antara lain analgesik (Lutterodt & Malique, 1988; Shaheen et al., 2000; Ojewole, 2006), antiinflamasi (Ojewole, 2006), antimutagenik (Grover & Bala, 1993), antidiare (Almeida et al., 1995; Lutterodt et al., 1999; Zhang et al., 2003; Goncalves et al., 2005; Salgado et al., 2006; Belemtougri et al., 2006; Kamath et al., 2008), antibatuk (Jaiarj et al., 1999), antibakteri (Jaiarj et al., 1999; Lutterodt et al., 1999; Nascimento et al., 2000; Vieira et al., 2001; Arima & Danno, 2002; Holetz et al., 2002; Limsuwan et al., 2005; Voravuthikunchai & Kitpipit, 2005; Akinpelu & Onakoya, 2006; Rattanachaikunsopon & Phumkhachorn, 2007; Nair & Chanda, 2007; Chansue et al., 2007; Kamath et al., 2008), antijamur (Sato et al., 2000),  antiplak gigi (Razak et al., 2006),  menekan inotropisme otot jantung (Garcia et al., 2003), antidiabetes (Oh et al., 2005; Ojewole, 2005; Kamath et al., 2008; Wu et al., 2009), anticestoda (Tangpu & Yadav, 2005, 2006), antihipertensi (Ojewole, 2005; Belemtougri et al., 2006; Olatunji-Bello et al., 2007), hepatoprotektif (Roy et al., 2006; Kamath et al., 2008), antikoagulan (Hsieh et al., 2007) dan antioksidan (Qian & Nihorimbere, 2004; Abreu et al., 2006; Tachakittirungrod  et al., 2007a,b; Chen & Yen, 2007; Wang et al., 2007; Ayoola et al., 2008; Kamath et al., 2008). Malahan daun jambu biji telah terbukti secara klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada anak-anak (Wei et al., 2000) dan menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002). 
Efek farmakologis tersebut disebabkan oleh berbagai kandungan kimia dalam daun jambu biji seperti senyawa fenolat, flavonoid, karotenoid, terpenoid dan triterpen (Gutierrez et al., 2008; Kamath et al., 2008). Ekstrak kental daun jambu biji mengandung kuersitrin, minyak atsiri, tanin, -sitosterol dan asam guaiakolat (Badan POM, 2004).  Selain itu berbagai kajian fitokimia telah menemukan kandungan kimia daun jambu biji yang lebih rinci, antara lain senyawa fenolat total 575,3 mg/g daun kering (Qian & Nihorimbere, 2004),  kuersetin 0,181 – 0,393% (El Sohafy et al., 2009), morin, morin-3-O-liksosida, morin-3-O-arabinosa, kuersetin dan kuersetin-3-0-arabinosida (Arima & Danno, 2002; Rattanachaikunsopon & Phumkhachom, 2007), guaijavarin (Arima & Danno, 2002), guajadial (Yang et al., 2007), asam ferulat (Chen & Yen, 2007)
Karena pentingnya daun jambu biji dalam pengobatan, maka mutu, keamanan dan kemaanfaatannya harus ditingkatkan melalui penelitian dan pengembangan. Untuk meningkatkan mutu, keamanan dan kemanfaatan daun jambu biji sebagai obat bahan alam Indonesia, perlu dilakukan standardisasi terhadap bahan bakunya, baik yang berupa simplisia maupun yang berbentuk ekstrak atau sediaan galenik. Salah satu faktor yang mempengaruhi mutu ekstrak tumbuhan obat adalah konsentrasi pelarut yang digunakan untuk ekstraksi (Gaedcke et al., 2003). Pelarut yang dapat digunakan untuk membuat ekstrak daun jambu biji adalah campuran etanol dan air (Badan POM, 2004). Namun perbandingan pelarut dan air untuk ekstraksi belum dioptimasi. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk menentukan perbandingan etanol dan air yang cocok untuk ekstraksi senyawa fenolat dari daun jambu biji sehingga didapat ekstrak yang bermutu baik. 
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbandingan pelarut etanol dan air yang cocok untuk memperoleh ekstrak daun jambu biji yang bermutu baik. Paramater mutu ekstrak daun jambu biji yang diukur adalah perolehan ekstraktif (rendemen ekstrak), kadar senyawa fenolat dan aktivitas antioksidannya (Ditjen POM, 2000).

METODE PENELITIAN
•	Bahan Tumbuhan
Daun jambu biji dikumpulkan dari daerah sekitar kampus Universitas Andalas, Limau Manih, Padang pada bulan Juli 2009. Tumbuhan ini diidentifikasi di Herbarium Universitas Andalas dan spesimennya disimpan di Laboratorium Kimia Farmasi, Universitas Andalas dengan Nomor Koleksi HR-20090702.
•	Bahan Kimia
Natrium karbonat p.a. (Merck), asam galat (Sigma), etanol p.a (Merck), Reagen Folin-Ciocalteau (Merck), DPPH (Sigma), etanol p.a. (Merck), metanol p.a. (Merck) dan air suling.
•	Alat
	Seperangkat alat rotary evaporator (Buchi®), oven (Memmert®), timbangan analitik (Shimadzu® AUX 220) dan alat spektrofotometer UV–Visibel (Shimadzu®  1240).
•	Pengeringan daun jambu biji
Daun jambu biji dicuci dan ditiriskan, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu ± 40 oC sampai kadar air < 10%. Pengeringan daun jambu biji dalam oven pada suhu 40 oC adalah cara pengeringan yang terbaik sesuai dengan penelitian terdahulu.
•	Ekstraksi daun jambu biji dengan pelarut etanol-air.
Bagian-bagian daun jambu biji kering ditimbang masing-masing 5 gram dan direndam masing-masing dengan 50 mL campuran etanol-air dengan perbandingan masing-masing 100:0, 80:20, 70:30, 60:40, dan 50:50 selama 24 jam sambil sekali-sekali diaduk. Maserat dipisahkan dan sisanya dimaserasi lagi dengan pelarut yang sama sampai tersari sempurna. Masing-masing maserat digabung lalu diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu <50ºC sampai kental. Sebelum dianalisis, masing-masing ekstrak dilarutkan dalam labu ukur sampai 50 mL dengan campuran air suling : metanol (1:1). 
•	Penentuan kadar ekstraktif (rendemen)
Penentuan kadar ekstraktif (rendemen ekstrak) yang diperoleh dengan berbagai perbandingan pelarut etanol-air di atas dilakukan menurut metode WHO (1998) sebagai berikut: Larutan ekstrak yang telah disiapkan dengan cara di atas dipipet sebanyak 10 mL ke dalam piring penguap yang telah ditara. Pelarutnya diuapkan di atas penangas air sampai kering. Sisanya dipanaskan dalam oven pada suhu 105 oC selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang segera. Pengeringan dan penimbangan diulangi beberapa kali sampai diperoleh bobot konstan. Kadar ekstraktif (rendemen) dinyatakan sebagai mg ekstrak per gram simplisia kering (mg/g).
•	Penentuan kadar senyawa fenolat total 
		Kadar senyawa fenolat total dalam larutan ekstrak daun jambu biji ditentukan dengan pereaksi Folin-Ciocalteau menggunakan prosedur yang dipakai Pourmorad et al. (2006). Larutan encer masing-masing ekstrak daun jambu biji (0,5 mL, ekstrak 1:10) atau larutan asam galat (senyawa fenolat standar) dicampur dengan pereaksi Folin-Ciocalteau (5 mL, diencerkan 1:10 dengan air suling) dan larutan natrium karbonat (4 mL, 1 M). Campuran tersebut dibiarkan selama 15 menit dan kadar senyawa fenolat ditentukan dengan mengukur serapan pada panjang gelombang 765 nm dengan spektrofometer UV-Vis. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan standar asam galat dengan konsentrasi 25, 50, 75, 100 dan 125 µg/mL dalam metanol-air (1:1). Kadar senyawa fenolat total dinyatakan sebagai mg setara asam galat per gram simplisia kering (mg/g).
•	Pengukuran Aktivitas Antioksidan 
Aktivitas antioksidan ekstrak daun jambu biji ditentukan dengan metode DPPH yang digunakan oleh Mosquera et al. (2009). Masing-masing ekstrak encer daun jambu biji sebanyak 1 mL dicampur dengan 2 mL larutan DPPH (20 mg/L) yang baru dibuat. Masing-masing campuran itu dikocok dan didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar di tempat gelap. Kemudian serapan masing-masing campuran itu diukur pada panjang gelombang 517 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Sebagai blanko, digunakan larutan yang dibuat dengan mencampurkan 1 mL metanol-air (1:1)  dengan 2 ml larutan DPPH (20 mg/L). Untuk meniadakan serapan ekstrak pada panjang gelombang ini, sampel blanko dibuat dengan mencampurkan 1 ml ekstrak dengan 2 ml metanol-air (1:1). Persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Di sini Akontrol adalah serapan larutan DPPH tanpa ekstrak, Aekstrak adalah serapan ekstrak uji yang sama dengan serapan ekstrak tumbuhan obat + DPPH dikurangi dengan serapan ekstrak blanko tanpa DPPH.
Nilai IC50 ekstrak tumbuhan obat ditentukan dengan mengukur persentase aktivitas antioksidan larutan ekstrak tumbuhan dengan konsentrasi 100, 50, 25, 12,5 dan 6,76 mg/mL melalui analisis regresi linear. Nilai IC50 dihitung sebagai kadar (mg/mL) larutan ekstrak tumbuhan obat yang menyebabkan aktivitas antioksidan sebesar 50%.
•	Analisis Statistika
Data percobaan dianalisis dengan menggunakan analisis variansi satu arah dan perbedaan antar rata-rata setiap perlakuan ditentukan dengan uji rentang berganda Duncan dengan menggunakan program komputer SPSS for Windows Version 10.0. Nilai P kecil dari 0,05 dianggap mempunyai perbedaan yang signifikan secara statistik

HASIL DAN DISKUSI
•	Validasi metode analisis senyawa fenolat total
Pengukuran kadar senyawa fenolat total dalam ekstrak daun jambu biji kering dilakukan dengan menggunakan pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah digunakan sebelumnya oleh Pourmorad et al. (2006) untuk penentuan kadar senyawa fenolat dalam tumbuhan obat di Iran. Agar metode itu dapat dipakai dalam penelitian ini, unjuk kerja dan validasi metode tersebut harus dievaluasi terlebih dahulu karena sampel yang dipakainya berbeda dari yang dipakai dalam penelitian ini. Kriteria yang digunakan untuk mengevaluasi metode analisis disebut figures of merit (Mitra dan Brukh, 2003). Hasil evaluasi dan validasi metode tersebut menunjukkan persamaan regresi hubungan antara serapan (y) dan kadar senyawa fenolat (x) sebagai y = 0,0158 + 0,0064 x, dengan koefisien korelasi r = 0,9967, rentang linearitas 25 – 125 µg/mL, batas deteksi 11,172 µg/mL, batas kuantisasi 37,240 µg/mL, perolehan kembali 97% dan simpangan baku relatif 0,24%. Hasil evaluasi tersebut menunjukkan bahwa metode analisis untuk menentukan kadar senyawa fenolat secara spektrofotometri dengan pereaksi Folin-Ciocalteau mempunyai ketepatan dan ketelitian yang tinggi sesuai dengan batas-batas unjuk kerja yang baik (Harmita, 2004)
•	Pengaruh perbandingan pelarut etanol-air terhadap perolehan kadar ekstraktif dari daun jambu biji
Tabel I memperlihatkan kadar ekstraktif yang diperoleh dari daun jambu biji kering yang diekstraksi dengan berbagai perbandingan etanol-air. Penurunan perbandingan etanol-air sampai 50:50 menyebabkan peningkatan kadar ekstraktif sampai 97,87 ± 1,01 mg/g. Namun demikian, penurunan perbandingan etanol-air lebih lanjut sampai 40:60 akan menurunkan kembali perolehan kadar ekstraktif menjadi 87,57 ± 2,78mg/g. Uji statistik menunjukkan bahwa perbandingan pelarut etanol-air berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap perolehan kadar ekstraktif dari daun jambu biji. Namun demikian perbandingan etanol-air 60:40 tidak berbeda nyata dengan perbandingan etanol-air 50:50 (p>0,05). Karena itu, perbandingan pelarut etanol-air yang optimum untuk memperoleh kadar ekstraktif yang tertinggi dari daun jambu biji adalah 50:50 (lihat Gambar 1). 

Tabel I.	Pengaruh perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi terhadap perolehan kadar ekstraktif, kadar senyawa fenolat total dan aktivitas antioksidan dari daun jambu biji 

Perbandingan
etanol-air	Kadar ekstraktif (mg/g)*	Kadar Fenolat (mg/g)*	IC50
(mg/mL)	
100 : 0	58,97 ± 4,85a	28,53 ± 0,30a	7,702	
80 : 20	64,23 ± 1,50b	33,16 ± 0,12b	7,503	
70 : 30	71,27 ± 1,21c	49,44 ± 0,30c	7,313	
60 : 40	93,80 ± 1,97d	57,60 ± 1,18d	7,287	
50 : 50	97,87 ± 1,01d	66,88 ± 0,43e	7,033	
40 : 60	87,57 ± 2,78e	55,06 ± 0,09f	7,917	

* Kadar dihitung dalam satuan mg per g berat kering, nilai rata-rata ± SD, n = 3; nilai yang mempunyai angka superskrip yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan (p < 0,05)

•	Pengaruh perbandingan pelarut etanol-air terhadap perolehan kadar senyawa fenolat dari daun jambu biji
Ekstraksi daun jambu biji dengan etanol saja akan diperoleh kadar senyawa fenolat sebesar 28,53 ± 0,30 g/mg berat kering (Tabel I). Penambahan air sebanyak 20% kepada etanol menyebabkan peningkatan kadar senyawa fenolat menjadi 33,16 ± 0,12 mg/g, penambahan air 30% menyebabkan peningkatan kadar senyawa fenolat menjadi 49,44 ± 0,30 mg/g, penambahan air 40% menyebabkan peningkatan kadar senyawa fenolat menjadi 57,60 ± 1,18 mg/g dan penambahan air 50% menyebabkan peningkatan kadar senyawa fenolat menjadi 66,88 ± 0,43 mg/g. Namun demikian, penambahan air 60% malahan menyebabkan penurunan kadar senyawa fenolat menjadi 55,06 ± 0,09 mg/g. Uji statistik menunjukkan bahwa perbandingan pelarut etanol-air berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap perolehan kadar senyawa fenolat dari daun jambu biji. Perbandingan pelarut etanol-air yang optimum untuk memperoleh kadar senyawa fenolat yang tertinggi dari daun jambu biji adalah 50:50 (lihat Gambar 2). 

Gambar 1. 	Pengaruh perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi terhadap perolehan kadar ekstraktif dari daun jambu biji

Gambar 2. 	Pengaruh perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi terhadap perolehan kadar senyawa fenolat dari daun jambu biji

•	Pengaruh perbandingan pelarut etanol-air terhadap aktivitas antioksidan dari daun jambu biji
Tabel I memperlihatkan perbandingan pelarut etanol-air terhadap aktivitas antioksidan daun jambu biji. Pengurangan perbandingan etanol-air dari 100:0 menjadi 80:20 sebagai pelarut untuk ekstraksi daun jambu biji menyebabkan peningkatan aktivitas antioksidan dari IC50 7,702 mg/mL menjadi 7,503 mg/mL.. Semakin tinggi angka IC50 semakin rendah aktivitas antioksidan. Pengurangan perbandingan etanol-air lebih lanjut dapat meningkatkan aktivitas antioksidan, namun perbandingan etanol-air yang optimum adalah 50:50 (Gambar 3).

Gambar 3. 	Pengaruh perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi terhadap aktivitas antioksidan (IC50) dari daun jambu biji

KESIMPULAN
Perbandingan etanol-air sebagai pelarut ekstraksi untuk daun jambu biji mempunyai pengaruh yang nyata (p<0,05) terhadap perolehan ekstraktif, kadar senyawa fenolat dan aktivitas antioksidan. Perbandingan etanol-air yang optimum untuk memperoleh kadar ekstraktif, kadar senyawa fenolat dan aktivitas antioksidan yang tertinggi dari daun jambu biji adalah 50:50. Perbandingan etanol-air 60:40 tidak berbeda nyata (p>0,05) pengaruhnya terhadap perolehan ekstraktif dengan perbandingan etanol air 50:50 sebagai pelarut ekstraksi.

DAFTAR PUSTAKA
Abreu, P.R.C., Almeida, M.C., Bernardo, R.M., Bernardo, L.C., Brito, L.C., Garcia, E.A.C., Fonseca, A.S., and Bernardo-Filho, M., 2006, Guava extract (Psidium guajava) alters the labelling of blood constituents with technetium-99m, J. Zhejiang Univ. Science B, 7(6), 429-435
Akinpelu, D.A., and Onakoya, T.M., 2006, Antimicrobial activities of medicinal plants used in folklore remedies in south-western, Afr. J. Biothenol., 5(11), 1078-1081
Almeida, C.E., Karnikowski, M.G.O., Foleto, R., and Baldisserotto, B., 1995, Analysis of antidiarrhoeic effect of plants used in popular medicine, Rev. SaudePublica, 29(6), 428-433  
Arima, H., and Danno, G., 2002, Isolation of antimicrobial compounds from guava (Psidium guajava L.) and their structural elucidation, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66(8), 1727-1730
Ayoola, G.A., Coker, H.A.B., Adesegun, S.A., Adepoju-Bello, A.A., Obaweya, K., Wzennia, E.C., and Atangbayila, T.O., 2008, Phytochemical screering and antioxidant activities of some selected medicinal plants used for malaria therapy in Southwestern Nigeria, Trop. J. Pharm. Res., 7(3), 1019-1024 
Badan POM, 2004, Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Volume 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia.
Belemtougri, R.G., Constantin, B., Cognard, C., Raymond, G., and Sawadago, L., 2006, Effects of two medicinal plants Psidium guajava L. (Myrtaceae) and Diospyros mespiliformis L. (Ebenaceae) leaf extracts on rat skeletal muscle cells in primary culture, J. Zhejiang Univ. Science B, 7(1), 56-63 
Chansue, N., Aroonseang, S., Assawawongkasem, N., and Tangtongpirot, J., 2007, Antimicrobial effects of guava leaf (Psidium guajava Linn.) extract against Aeromonas hydrophila in fancy carp (Cyprinus carpio), Somgklanakarin J. Sci. Technol., 29(Suppl.1), 69-81 
Chen, H.Y., and Yen, G.C., 2007, Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of extracts from guava (Psidium guajava L.) leaves, Food Chemistry, 101(2), 686-694
Ditjen POM, 1989, Vademikum Bahan Obat Alam, Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia
Ditjen POM, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia 
El Sohafy, S.M., Metwalli, A.M., Harraz, F.M., and Omar, A.A., 2009, Quantification of flavonoids of Psidium guajava L. preparations by planar chromatography (HPTLC), Phcog Mag., 4(17), 61-66
Gaedcke, F., Steinhoff, B. and Blasius, H., 2003, Herbal Medicinal Products: Scientific and Regulatory Basis for Development, Quality Assurance and Marketing Authorisation, Stuttgart: Medpharm Scientific Publisher 
Garcia, E.A., Nascimento, V.T., and Santos, A.B.S., 2003, Inotropic effects of extracts of Psidium guajava L. (guava) leaves on the guinea pig atrium, Brazilian J. Med. Biol. Res., 36, 661-668
Goncalves, J.L.S., Lopes, R.C., Olivera, D.B., Costa, S.S., Miranda, M.M.F.S., Romanos, M.T.V., Santos, N.S.O., and Wigg, M.D., 2005, In vitro anti-rotavirus activity of some medicinal plants used in Brazil against diarrhea, J. Ethnopharmacol., 99, 403-407
Grover, I.S., and Bala, S., 1993, Studies on antimutagenic effect of Guava (Psidium guajava) in Salmonella typhimurium, Mutat. Res., 300(1), 1-3
Gutierrez, P.M.P., Mitchell, S., and Solis, R.V., 2008, Psidium guajava: a review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology, J. Ethnopharmacol., 117(1), 1-27
Harmita, 2004, Petunjuk pelaksanaan validasi metode dan cara perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-135
Holetz, F.B.H., Pessini, G.L., Sanches, N.R., Cortez, D.A.G., Nakamura, C.V., and Filho, B.P.D., 2002, Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 97, 1-5
Hsieh, C.L., Lin, Y.C., Yen, G.C., and Chen, H.Y., 2007, Preventive effects of guava (Psidium guajava L.) leaves and its active compounds against -dicarbonyl compounds-induced blood coagulation, Food Chemistry, 103(2), 528-535
Jaiarj, P., Khoohaswan, P., Wongkrajang, Y., Peungvicha, P., Suriyawong, P., Saraya, M.L.S., and Ruangsomboon, O., 1999, Anticough and antimicrobial activities of Psidium guajava Linn. leaf extract, J. Ethnopharmacol., 67(2), 203-212
Kamath, J.V., Rahul, N., Kumar, C.K.A., and Lakshmi, S.M., 2008, Psidium guajava L: a review, Int. J. Green Pharmacy, 2(1), 9-12
Limsuwan, S., Vanmanee, S., and Voravuthikunchai, S., 2005, Effect of Thai medicinal plant extracts on cell aggregation of Escherichia coli O157:H7, Songklanakarin J. Sci. Technol., 27(Suppl. 2), 545-554
Lozoya, X., Reyes-Morales, H., Chavez-Soto, M.A., Martinez-Garcia, M.C., Soto-Gonzales, Y., and Doubova, S.V., 2002, Intestinal anti-spasmodic effect of a phytodrug of Psidium guajava folia in the treatment of acute diarrheic disease, J Etnopharmacol., 83(1-2), 19-24
Lutterodt, G.D., and Maleque, A., 1988, Effects on mice locomotor activity of a narcotic-like principle from Psidium guajava leaves, J. Ethnopharmacol., 24(2-3), 219-231
Lutterodt, G.D., Ismail, A., Basheer, R.H., and Baharudin, H.M., 1999, Antimicrobial effects of Psidium guajava extract as one mechanism of its antidiarrhoeal action, Malaysian J. Med. Sci., 6(2), 17-20
Mitra, S., and Brukh, R., 2003, Sample Preparation: An Analytical Perspective, in Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, (Ed: Mitra, S.), New York: John Wiley & Sons, Inc., 1-36
Mosquera, O. M., Correa, Y.M., and Nino, J., 2009, Antioxidant activity of plants extract from Colombian flora, Braz. J. Pharmacogn., 19(2A), 382-387
Nair, R., and Chanda, S., In-vitro antimicrobial activity of Psidium guajava L. leaf extracts against clinically important pathogenic microbial strains, Brazilian J. Microbiol., 38, 452-458
Nascimento, G.G.F., Locatelli, J.L., Freitas, P.C., and Silva, G.L., 2000, Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria, Brazilian J. Microbiol., 31, 247-256
Oh, W.K., Lee, C.H., Lee, M.S., Bae, E.Y., Sohn, C.B., Oh, H., Kim, B.Y., and Ahn, J.S., 2005, Antidiabetic effects of extracts from Psidium gyajava, J. Ethnopharmacol. 96(3), 411-415
Ojewole, J.A., 2005, Hypoglycemic and hypotensive effects of Psidium guajava Linn. (Myrtaceae) leaf aqueous extract, Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol., 27(10), 689-695
Ojewole, J.A.O., 2006, Anti-inflammatory and analgesic effects of Psidium guajava Linn. (Mysrtaceae) leaf aqueous extracts in rats and mice, Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol., 28(7), 441
Olatunji-Bello, I.I., Odusanya, A.J., Raji, I., and Ladipo, C.O., 2007, Contractile effect of the aqueous extract of Psidium guajava leaves on aortic rings in rat, Fitoterapia, 78(3), 241-243
Pourmorad, F., Hosseinimehr, S.J.  and Shahabimajd, N., 2006, Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, Afr. J. Biotechnol., 5(11),1142-1145
Qian, H., and Nihorimbere, V., 2004, Antioxidant power of phytochemicals from Psidium guajava leaf, J. Zhejiang Univ. Sci., 5(6), 676-683
Rattanachaikunsopon, P., and Phumkhachom, P., 2007, Bacteriostatic effect of flavonoids from leaves of Psidium guajava on fish pathogens, Fitoterapia, 78(6), 434-436
Razak, F.A., Othman, R.Y., and Rahim, Z.H.A., 2006, The effect of piper betle and Psidium guajava extracts on the cell-surface hydrophobicity of selected early settlers of dental plaque, J. Oral Sci., 48(2), 71-75
Roy, C.K., Kamath, J.V., and Asad, M., 2006, Hepatoprotective activity of Psidium guajava Linn. leaf extract, Indian J. Exp. Biol., 44(4), 305-311 
Salgado, H.R.N., Roncari, A.F.F., Michelin, D.C., and Moreira, R.R.D., 2006, Evaluation of antidiarrhoeal effects of Psidium guajava L. (Myrtaceae) aqueous leaf extract in mice, J. Bas. Appl. Pharm. Sci., 27(1), 89-92
Sato, J., Goto, K., Nanjo, F., Kawai, S., and Murata, K., 2000, Antifungal activity of plant extracts against Arthrinium sacchari and Chaetomium funicola, J. Biosci. Bioeng., 90(4), 442-446
Shaheen, H.M., Ali, B.H., Alqarawi, A.A., and Bashir, A.K., 2000, Effect of Psidium guajava leaves on some aspects of the central nervous system in mice, Phytother Res., 14(2), 107-111
Sudibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan: Manfaat dan Kegunaan, Jakarta: Balai Pustaka
Tachakittirungrod, S., Okonogi, S., and Chowwanapoonpohn, S., 2007a, Study on antioxidant activity of certain plants in Thailand: Mechanism of antioxidant action of guava leaf extract, Food Chemistry, 103(2), 381-388
Tachakittirungrod, S., Ikegami, F., and Okonogi, S., 2007b, Antioxidant active principles isolated from Pidium guajava grown in Thailand, Sci. Pharm., 75, 179-193
Tangpu, T.V., and Yadav, A.K., 2005, Anticestodal efficacy of folklore medicinal plants of Naga  Tribes in North-East India, Afr. J. Trad. CAM, 2(2), 129-133
Tangpu, T.V., and Yadav, A.K., 2006, Anticestodal efficacy of  Psidium guajava  against experimental Hymenolepis diminuta infection in rats, Indian J. Pharmacol., 38(1), 29-32
Vieira, R.H.S.F., Rodrigues, D.P., Goncalves, F.A., Menezes, F.G.R., Aragao, J.S., and Sousa O.V., 2001, Microbicidal effect of medicinal plant extracts (Psidium guajava Linn. and Carica papaya Linn.) upon bacteria isolated from fish muscle and known to induce diarrhea in children, Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, 43(3), 145-148
Voravuthikunchai, S., and Kitpipit, L., 2005, Antibacterial activity of crude extracts of Thai medicinal plants against clinical isolates of methicillin-resistant Staphylicoccus aureus, Songklanakarin J. Sci. Technol., 27(Suppl. 2), 525-534 
Wang, B., Jiao, S., Liu, H., and Hong, J., 2007, Study on antioxidative activities of Psidium guajava Linn. leaves extracts, Wei Sheng Yan Jiu, 36(3), 298-300
Wei, L., Li, Z., and Chen, B., 2000, Clinical study on treatment of infantile rotaviral enteritis with Psidium guajava L., Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, 20(12), 893-895
WHO, 1998, Quality control Methods for  medicinal plant materials, Geneva: World Health Organization.
Wu, J.W., Hsieh, C.L., Wang, H.Y., and Chen, H.Y., 2009, Inhibitory effects of guava (Psidium guajava L.) leaf extracts and its active compounds on the glycation process of protein, Food Chemistry, 113(1), 78-84
Yang, X.L., Hsieh, K.L., and Liu, J.K., 2007, Guajadial: an unusual meroterpenoid from guava leaves Psidium guajava, Organic Letters, 9(24), 5135-5138
Zhang, W.J., Chen, B.T., Wang, C.Y., Zhu, Q.H., and Mo, Z.X., 2003, Mechanism of quercetin as an antidiarrheal agent, Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 23(10), 1029-1031